β-таласемията е сред най-често срещаните генетични заболявания, с тежки последствия и с голямо разпространение в цял свят. Независимо от изследванията и превенцията, все още съществуват повече от 10 000 регистрирани хомозиготни носители. Реализират се успешни генетични програми към специфични особености и територии. Клинично болестта се изразява с анемия, която е в три форми: таласемия майор – хомозиготна, таласемия интермедия и таласемия минор, която представлява само носителство за единична мутация в един алел.
Представеният клиничен случай представлява оценка на нов метод за изследване с rtPCR при пациенти с анемия, които са със съмнение за носителство на мутация в хемоглобиновия ген, за определяне типа на мутацията и схемата на унаследяването. От кръвна проба, получена от засегнат пациент и семейството му, в болницата за активно лечение „Д-р Атанас Дафовски” в Кърджали, е изолирана геномна ДНК, която е изследвана за мутации в хемоглобиновия ген чрез rtPCR.
Методът, който използвахме в настоящото проучване, оценяваме като много подходящ за болницата, където има нужда от бърз и точен анализ за таласемийно носителство. Резултатите, които представяме по метода присъства/отсъства, както и дизайнът на теста предоставят възможности за бърз анализ.
Представеният метод е бърз и подходящ за оценка на специфичните и най-често срещани мутации в региона на Югоизточните Родопи.
Таласемията е специфичен вид хемоглобинопатия. Циркулиращите хемоглобинови фракции са повече от 96% от общото количество хемоглобин при възрастни индивиди и се състоят от 2 алфа и 2 бета вериги (α2β2); тетрамери. Те са кодирани от 4 α и 2 β гени. Съществуват повече от 600 вида мутации от автономно-рецесивен характер в тези гени, водещи до нарушена структура на β-Hb (хемоглобинози), или водещи до дефекти в синтезата на β- или α-вериги на глобиновите молекули и представляват β- или α-таласемии, съответно. От всички описани, най-голям интерес представляват β-таласемиите поради по-голямата им честота в региона на Югоизточните Родопи. Другите хемоглобинопатии са или много редки или не се срещат в региона.
Задълбочени изследвания на хемоглобинопатиите в рамките на последните няколко години показват намаляване на инцидентите на хомозиготност. Към този момент обаче са регистрирани около 10 000 хомозиготни носители в Европа и САЩ. Проучено е, че мутациите на хемоглобина са свързани с маларията и разпространението на комарите, затова се наблюдава повече носителство в района на Средиземноморието, Северна Африка, Близкия изток, Арабския полуостров, Индия, Индонезия. В някои региони честотата може да достигне от 0,1% в Източна Европа до 16% в Кипър, като честотата на засегнатите фетуси към 1000 бременности варира между 0,0003 и 5,12 (в Кипър).
Много различни мутации водят до β-таласемия, унаследяеми като много различни генетични комбинации, определящи хетерогенна група с клинични показатели. При таласемия минор – много често срещана като β-таласемия или хетерозиготна β-таласемия, има само една единична β-таласемична мутация и нормален β-глобинов ген на другата хромозома. Микроцитоза, хипохромия, високи нива на HbA2 и слаба до минимална анемия са характеристиките на този тип таласемийни носители. Състоянието клинично е асимптоматично и няма нужда от специфична терапия. При някои пациенти се наблюдават слаба до значителна микроцитоза и хипохроматична анемия, свързани с повишеното ниво на еритроцитите и ниското ниво на MCV показатели на кръвната картина, както и MCH. Перфектната кръвна натривка от такива пациенти показва картината на микроцитоза и хипохроматична анизоцитоза, пойкилоцитоза и ядрени червени кръвни клетки (еритробласти).
Анемията при таласемия майор е толкова тежка, че е задължителна нуждата от непрекъснати кръвопреливания, която повишава абсорбцията на желязо и депонирането му в много от вътрешните органи (черен дроб, ендокринни тъканни жлези, сърце), а крайният изход може да бъде летален, ако не се прилага хелатотерапия. Анализ на хемоглобина показва главно HbF фракции плюс малко количество HbA2 при β⁰ хомозиготи, но недостатъчно да компенсират загубата на HbA, така че Hb нивата остават <5 g/dL. Повечето β⁺ хомозиготи и β⁺β⁰ комбинирани хетерозиготи също са с таласемия майор. HbF остава доминантна компонента, но вариращите нива на HbA зависят от специфичния β⁺ таласемичен алел. Понятието β-таласемия интермедия се отнася за по-лек фенотип, при който няма толкова значителна анемия, но хронична терапия на кръвопреливане невинаги се налага. Пациентите определено показват хетерозиготност, която варира по тежест от типа на β-таласемийните носителства до степен на таласемия майор. Повечето пациенти с таласемия интермедия са хомозиготни или са с комбинация от хетерозиготност тип β-таласемия, като при тях и двата локуса на β-глобина са засегнати. Малко по-рядко се срещат тези с един единствен локус, засегнат в β-глобиновия ген, а другият е съвсем нормален. Леките клинични характеристики на таласемия интермедия в сравнение с таласемия майор са поради унаследяването на две β-таласемийни мутации, една по-лека и една тежка. Унаследяването на две по-леки мутации или понякога предаването на по-сложни комбинации се изразява например в две β-таласемийни мутации, ко-унаследени с хетерозиготна α-таласемия. В тази форма, също известна като αβ-таласемия, α-таласемийният алел намалява тежестта на несвързаните α-глобинови вериги.
β-глобиновият ген е на късото рамо на хромозома 11 и е около 80 Kb дълъг, който съдържа също последователност за δ глобиновия ген, ембрионния ε ген, феталния Aγ ген и Gγ ген. Петте функционални глобинови гена са подредени в хромозомата по реда на тяхната експресия.
Формите на β-таласемия са от мутации, които засягат всяка една стъпка от формирането на глобиновите молекули: транскрипцията, обработката на иРНК, транслацията на зрялата иРНК и посттранслационни модификации на β-полипептидната верига.
Около 200 различни алела на β-глобиновия ген са открити и описани при състояния на таласемии, повечето от тях са точкови мутации или грешки в крайните последователности. Разпределението на тези алели варира значително в различните популации, но в рамките на една и съща популация съществуват само няколко алела. Повечето алели са средиземноморски рецесивни, но има и варианти, които дават клинична изява дори и в присъствието на едно единствено копие. Те представляват доминантно-негативните и са известни също като доминантно унаследени β-таласемии. Състояния с повишен синтез на HbF за компенсация са известни като унаследяеми стабилни състояния на фетален хемоглобин (HPFH) и хомозиготните са клинично незасегнати, докато хетерозиготните с β-таласемия са много леки. Феталният хемоглобин е често срещан модификатор при тежки клинични случаи на β-таласемия. При нормални индивиди само 5-8% от еритроцитите, наречени F клетки, съдържат HbF – 5-20% от цялостното количество хемоглобин в тези видове клетки.
При лечение най-добрата възможност са стволовите клетки при пациенти с таласемия майор, но при този вариант има все още потенциални рискове от смърт или усложнения. Трансплантацията на кръв от пъпна връв има ограничен успех при лечението на β-таласемия поради факта, че големи количества са необходими за поддържане на нормалната хемопоеза на пациентите. Генетичната терапия за β-хемоглобинопатии е на фазата на ранни клинични проучвания и предлага отлични перспективи. Но дори и при успех на всички тези методи на молекулярна терапия, те са скъпи и не могат незабавно да бъдат приложени при пациенти, особено в страни с по-нисък икономически стандарт. Съществуват данни от клинични и генетични проучвания, които показват, че индукцията на синтез на γ-глобинови вериги чрез генетична трансдукция или фармакологично са с потенциална полза за пациенти с β-таласемия.
По-нови методи за лечение на пациенти с таласемия интермедия и таласемия майор са публикувани с употреба на Tf-хепсидинови агонисти и JAK2 инхибитори, това са само някои нови възможности за лечение.
В България според някои изследователи процентът на таласемия е около 2,5-3. Годишно се срещат 12-15 деца, които се раждат с някаква форма на тежка таласемия. На базата на кръвни тестове при рутинни хематологични изследвания е важно да се проучи и генетичното носителство при предполагаеми β-таласемии на пациентите.
В момента все още липсват точни и завършени данни, както и систематични проучвания за таласемията в България, както и описания на мутациите, което се оказва важен основен елемент за личните лекари и специалисти, но най-вече за пациентите.
В предишни проучвания установихме повишен процент на таласемийни носителства в региона на Кърджали и в близост до пограничните райони. Според тези наши изследвания, както и според резултатите от най-новите ни проучвания и непубликувани данни, има повече от 9% носителство при изследвания на по-разширен кръг от пациенти (не само бременни) в района, като точната мутация за всички засегнати предстои да бъде установена. Ние подозирахме висок процент носителство в региона и предполагахме, че се касае за процент, който се доближава до данните на Гърция и Турция, поради близостта на Средиземно море, от една страна, както и поради непрекъснатото движение и разместване на популациите и семействата.
Нашата цел бе да проучим повишения процент носителство в региона на Кърджали, както и в близкия пограничен район с Гърция, да определим видово най-често срещаните мутации, процента на превалентност, както и в каква степен те се застъпват в сравнение с териториите на Гърция и Турция, позовавайки се на техники на rtPCR и нов метод кит за β-таласемия за 6 най-често срещани мутации. Целта на конкретното изследване бе да установим мутации при семейно унаследяване и да докажем възможностите на кита в клинични условия.
Материали и методи
Клиничен случай: 43-годишна жена на амбулаторен преглед при личен лекар с оплаквания за леки, системни главоболия, ниско кръвно налягане (110/60 mmHg), дискомфорт по време на работа и особено по време на менструален цикъл. Тя описва също така състояния на чести треперения на ръцете и тремори, които отшумяват, понякога слабост и изтощеност на работа. При посещението й се забелязват бледност и загуба на тургур на кожата на лицето. Тя също така описва подобни, но по-изразени оплаквания при нейната 18-годишна дъщеря, а и малко по-слабо изразени оплаквания при другата, по-малка 17-годишна дъщеря. Съпругът е асимптоматичен. Пациентката описва тези епизоди като обичайно повтарящи се, но наскоро установени, засилващи се, като преди не е имала други такива.
При изследване на кръвна картина – CBC, се установява слаба хемоглобинемия при кръвна натривка, понижени нива на MCV, MCH и MCHC при жената, както и при останалите членове от семейството. Анализът по-нататък показва RDW повишен между 45 до 48.6fL за всички членове от семейството. RBC са били около 5.15×1012/L; HGB ~100-110 g/L; MCV ~ 65.8-72.5fL; MCH 19.4-20.6 pg; MCHC 295-308 g/L; ретикулоцити ~ 19-22‰ без данни за желязодефицитна анемия; sFe 21.6- 22 µmol/L; TIBC 53.6-56.1 µmol/L. Електролитите (Na, K, Ca, фосфати и Mg) са в норма. Общ билирубин без повишение – (14.0-15.1 µmol/L), но повече от половината е бил директен (7.8-6.8 µmol/L), индикатор за хронична хемолиза. Офталмологичният преглед и консултация, извършени на пациентката показват острота на зрението 1.0, нормална фундоскопия, негативна за кръг на Kayser-Fleischer, характерен за синдром на Уилсън. Не са били предоставени данни от ултрасонография за спленомегалия, както и отсъствие на жлъчни камъни.
Личният лекар с индивидуални прегледи, анамнеза, фамилна история, настоящо общо състояние и чрез регулярни посещения от страна на пациента, както и от кръвната картина, може да успее да определи съмнителните таласемийни носителства, както и да характеризира лабораторните изследвания – нисък хемоглобин, MCV и MCH са повишени, повишен брой еритроцити. Когато е необходимо, пациентът бива консултиран с хематолог и чрез по-нататъшни изследвания, за да се определи специфичната форма на таласемийния синдром. На семействата с таласемийно носителство е необходимо да се предостави възможност за генетични консултации.
След подписано информирано съгласие пациентката и нейното семейство са били по-нататък изследвани: гел електрофореза на еритроцитите за разделяне на хемоглобиновите фракции. Геномна ДНК е била изолирана от цяла кръв за определяне на мутациите. Работата беше извършена с новоразработения метод на SNP Biotechnology Ltd. Ankara, Турция, за определяне на възможни най-често срещани мутации в хемоглобиновия ген: IVS1-1, IVS1-110, IVS2-1, IVS2-745, IVS1-6 и Sickle cell. За изолация на геномна ДНК използвахме QIAamp DNA blood mini kit от Qiagen. За PCR- реакцията използвахме AB StepOne rtPCR система.
Резултати
Първо сравнихме общите резултати от пълната кръвна картина за всички четирима членове на семейството и техните резултати подсказваха таласемийно носителство. На кръвни натривки бяха установени хипохромия, анизоцитоза и сгъстена еритроцитна картина. Последваща електрофореза на четиримата е била извършена и резултатите са били с повишаване на процента на HbA2 фракции над 3,2%. Резултатите показаха HbA2 между 4,1 и 5,5, като също и нивата на HbF > 1%. Изследвахме семейството за шестте най-често срещани мутации. Резултатите посочват точкови мутации за всичките четирима членове на семейството.
От общо шестте възможни мутации, които изследвахме, майката се оказа носител на две: IVS1-110 и IVS2-745, бащата – носител на IVS2-745, а двете дъщери са носители на двете мутации IVS1-110 и IVS2-745 и хетерозиготност.
Дискусия
Нашите резултати представят много интересна находка на таласемийно унаследяване в рамките на едно семейство. Ние изследвахме по-нататък и други членове от разширеното семейство, като продължихме да откриваме същите мутации, едната или другата в зависимост от страната. Интересен факт за отбелязване е, че в конкретния случай при наличие на двама родители – носители, двете дъщери също са само носители. Тези мутации с бързо изследване, на базата на геномни изследвания, при мониторинг на общото им здравословно състояние дава значително предимство в мениджмънта на този синдром по-нататък. Дали биха били необходими кръвопреливане, медикаментозна терапия или допълнителни генетични консултации при бъдещо семейно планиране? Този тип изследване дава отговор и е добра основа и основание за насочена терапия. Генетичната консултация представлява важна страна от цялостната завършеност на проучването на такива случаи, за да даде насоки при семейни заболявания или потенциал за развитие на такива. Допълнителни пренатални ДНК анализи при евентуална нова бременност са наложителни – така важни решения могат да бъдат взети по отношение на съществуващи или потенциални рискове. Пренаталните тестове са дефинитивни и на тяхна база може да бъде поставена диагноза чрез амниоцентеза или хорионна биопсия в съответната гестационна седмица, препоръчана от микропедиатри и гинеколози за извършване на този вид манипулация. Нови неинвазивни методи на тестване на ембрионални ДНК фрагменти, циркулиращи в кръвта на майката, създават още по-добра перспектива за добра диагностика и мениджмънт на наследствените заболявания.
В ситуации, когато се натъкнем на пациенти с необходимите клинични симптоми, подсказващи β-таласемия, но при по-нататъшни изследвания не можем да определим точкова или друга такава мутация (което не може да бъде осъществено с този кит), не означава, че трябва да отхвърлим потенциалната диагноза таласемия. Необходими са по-нататъшни изследвания, разширен панел за мутациите или алтернативно да се секвенира цялостния хемоглобинов ген.
При все че нашето проучване индикира подобни мутации между българската и турската популация, по-нататъшни и задълбочени изследвания ще бъдат необходими, за да направим заключение.
Ограничения на проучването
Ограниченията на този метод, според нас, се дължат на факта, че се изследват само 6 мутации и някои потенциални носители могат да бъдат елиминирани при поставянето на точната диагноза на този етап от изследването. При все това, нашата цел е да използваме тази система в реално време, поради спецификите на нашия регион в близост до границата ни с Гърция и Турция, както и да продължим да изследваме нашата популация от смесен етнос. Според нас това проучване дава яснота по отношение на факта, че ние имаме много общи мутации с пограничното население от Турция и Гърция, което само се предполагаше досега. По-задълбочени проучвания ще бъдат необходими и от особена важност за регистриране на мутациите и тяхното движение в региона, както и в България.
Смятаме, че всеки хетерозиготен носител по отношение на таласемия трябва да бъде диагностициран и съответната мутация диференцирана – така ще се избягва по-нататъшен инцидент на фатално унаследяване на тежки наследствени аномалии, няма да се допуска раждане на деца с тежки форми на таласемия. Представеният метод е сравнително евтин и лесен за изпълнение и интерпретация за пациенти с анемия, съмнителни за носителство. Направихме оценка за състоянието на представеното семейство с една стъпка, бързо и категорично, което обуславя недвусмислена диагноза, обяснение за клиничното състояние и е предпоставка за по-добрия здравен мениджмънт.
