Драгомира Николова коментира приложението на микрочиповите технологии и хода на мащабното изследване.

Проектът, който реализирах в Япония, бе в областта на онкогенетиката. За изследване подбрах два вида карциноми – на щитовидната жлеза и на яйчника. Естествено, това стана с одобрението на ръководителите от Токио, които засвидетелстваха интерес към тази патология.

В проучването туморите бяха разгледани от генетична гледна точка. На пръв поглед двата типа карцином са различни. Ракът на щитовидната жлеза не е толкова животозастрашаващ, но често се появяват рецидиви в регионални лимфни възли, както и неврологична симптоматика. Овариалният карцином води до висока смъртност и често се диагностицира в късен стадий.

Целите на проучването бяха да се направи молекулен профил на генна експресия на дадения тип карцином, да се установи специфичното и общото между тях (тъй като е известно, че карциномите имат различен експресионен профил), да се определят молекулни маркери за ранна диагностика, както и молекулни таргети за прицелна терапия. До момента в България не е правено въобще молекулно профилиране – т.е. създаване на база данни на гени с променена експресия при даден тип рак при представители на българската популация.

Имах удоволствието да работя в едно от най-добрите места в областта на генетиката – Лаборатория по молекулна медицина към Човешкия геномен център на Токийския университет, в групата на проф. Юсуке Накамура. Проф. Накамура е един от откривателите на VNTR (Variable number of tandem repeats) полиморфизми, които се използват за генно идентифициране на индивида. Изследванията осъществих в екип с японски специалисти, които ми помогнаха при овладяването на някои нови техники. Проучването бе финансирано изцяло от японците.

Проектът стартира със събирането на проби от български пациенти, които бяха изпратени в Япония. Тази част бе осъществена с помощта на български лекари. Сериозни усилия бяха положени, за да бъдат транспортирани пробите от България до Япония при необходимите специфични условия.

Следващата задача бе да изолираме чисти клетъчни популации. Много важно бе при този анализ РНК в пробата да бъде съхранена интактна и съответно да бъде изолирана чиста хомогенна популация от ракови клетки, които да бъдат сравнени с нормални клетки. По този начин резултатите са сигнификантни, сигурни и достоверни. Използвах т.нар. лазерна микродисекция, с която селектирах и изрязах всяка клетка поотделно. В продължение на година и няколко месеца бяха селектирани чисти клетки от 22-ма пациенти с тироиден карцином, от 21 пациенти с овариален карцином, и съответния брой контроли. Събирането на материала е много бавен процес, тъй като изолираната РНК е с изключително малък обем, с малка концентрация и тя следва да бъде намножена.

В следващия етап анализирахме материалите с микрочипова технология. Използвахме микрочипове на фирмата Аffymetrix, която е един от безспорните лидери в света на микрочиповете. Този иновативен метод като цяло е една сканираща технология. Методът има сериозен потенциал, от една страна, да потвърди вече идентифицирани гени, а от друга – да открие нехарактеризирани до момента гени, които биха могли след това чрез функционален анализ да бъдат потвърдени.

Направихме молекулни профили на двата типа рак и решихме да ги сравним. Установихме различен брой високо и ниско експресирани гени. При тироидния карцином открихме около 200 гени с повишена експресия, а при овариалния – около 300. Тази разлика донякъде е логична, като се има предвид, че ракът на яйчника е много по-агресивен и с много по-голяма степен на метастазиране. Повечето от случаите на овариален карцином бяха в късен стадий – ІІІ и ІV.

В рамките на изследването идентифицирах и потвърдих с други методи два гена при тироидния карцином и един ген – при овариалния. Тоест след експресионния и софтуерния анализ на данни приложих функционален анализ. Целта на функционалния анализ е да определи експресията им в нормални тъкани. Ако тя бъде понижена и докажем, че гените са таргетни, при терапия с моноклонални антитела няма да бъдат засегнати нормалните тъкани.

Единият идентифициран ген бе RGS4, който се свързва с G-протеините и участва в сигналната трансдукция. Неговата роля по принцип се изследва във връзка с шизофренията и с формирането на неврони по време на ембрионалното развитие, но за пръв път се установява неговата свръхповишена експресия в тиреоидния карцином. Интересно бе, че той е с много ниска експресия в нормални тъкани и почти във всички клинични случаи е високо експресиран. На ин витро ниво с различни молекулни методи генът бе доказан като инвазионен фактор, подпомагащ метастазирането, и като важен растежен фактор за туморните клетки. Фактически стана ясно, че RGS4 е неидентифициран до момента, но добър таргет. Ето защо този ген най-вероятно ще бъде предмет на нови изследвания, вече на ин виво модели. Напълно възможно е терапията с моноклонални антитела срещу този таргет да има и реален ефект при клинични изследвания върху пациенти.

При тиреоидния карцином открихме и QPCT гена. Този ензим, доказан при изследването като секретируем протеин в кръвта, би могъл да бъде използван като маркерен ген за ранно диагностициране на рака на щитовидната жлеза. Бяха установени и посттранслационните модификации на двата протеина.

При овариалния карцином идентифицирахме таргетния ген CHMP4C (хроматин‑моделиращ протеин 4С). Смятам това откритие за постижение, защото генът наскоро бе установен като член на фамилията на хроматин моделиращите протеини. CHMP4C е свързан с везикуларния транспорт в клетката и вероятно има много важна функция.

В рамките на проекта направихме и изследване с РНК интерференцията, за да потвърдим значението на гените за туморния растеж. Получихме добри резултати и потвърдихме тези гени като важни за туморния растеж. Ето защо може би тяхното потискане би могло да има ефекта на свиване на тумора.

Оказа се още, че едва 13 от гените с повишена експресия са общи за двата типа рак. Това показва, че туморите имат много голяма експресионна хетерогенност, силно се различават по генната си експресия. Съответно таргетната терапия трябва да се развива специфично за всеки тип карцином.

Използвахме сериозен арсенал от методи – имуноцитохимия, имунохистохимия, РНК интерференция, растежни тестове, тестове за формиране на колонии, факсметоди и т.н.

Първото експресионно профилиране при тиреоиден карцином се извършва още през 2001 г., а при овариален тумор – през 2004 г. Доста проучвания са направени оттогава, но при повечето от тях не са установени тези гени. Най-вероятната причина да бъдат пропускани в предишните изследвания е, че в началото се е използвала изолирана ДНК от цели тъкани. А под микроскоп се вижда, че тази тъкан изобщо не е хомогенна. Преди 2-3 години въвеждането на лазерната микродисекция даде възможност да се селектират чисти клетъчни популации, благодарение на които установихме трите гена. Допълнителни тестове на пробите показаха, че процентът на контаминация бе около 1%.

Изследването даде добри резултати и смятам, че си заслужава да продължат проучванията върху тези гени. Такава бе и целта на нашия проект – не да проучваме вече доказани гени при ракови заболявания, а да открием гени, които тепърва да бъдат разработвани, които би могло да имат голям потенциал като таргетни гени. Надявам се проучванията да продължат, защото от двата карцинома заболяват много хора. Българските специалисти, които събраха пробите на пациентите с рак на щитовидната жлеза, засвидетелстваха интерес в продължаването на изследването на тази патология.

В бъдеще все по-често ще се говори за генна терапия, въпреки че тя е много скъпа. Ето защо водеща тенденция по целия свят в областта на медицинската генетика е обединяване на екипите на различни държави. Най-добрите генетични лаборатории в света се обединяват и създават консорциуми. Тази тенденция не подминава и нашата страна – активно работим с чуждестранните колеги.

В заключение искам да подчертая, че нашите методи не трябва да бъдат подценявани и възприемани само от научна гледна точка. Допреди 3-4 години например микрочиповете се използваха само за научни изследвания, днес те навлизат и в диагностиката. Те вече са патентовани и реално съществуват, но, разбира се, са много скъпи. Очакваме в бъдеще цената им да намалее…